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多光子显微镜用飞秒激光器

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多光子显微镜技术的突破 ???????????

 

多光子显微镜无需染料或标签即可进行3D高分辨率成像,彻底改变了生物成像。这项技术的一个重要方面是使用非常短的飞秒脉冲。这些脉冲的使用有几个优点,使多光子显微镜成为研究生物样品是有价值的工具。

  1. 多光子显微镜使用飞秒脉冲减少了对样品的光损伤。短脉冲最大限度地减少了曝光时间,减少了在成像过程中发生的光损伤量。这在活体样本的研究中尤为重要,因为它允许研究人员在不影响样本活力的情况下获得高分辨率图像。

多光子显微镜用飞秒激光器插图肺组织的多光子显微镜图像。阿姆斯特丹大学Groot Vrije教授有限公司

 

  1. 使用飞秒脉冲提高了双光子荧光的效率。这些脉冲的高峰值功率增强了非线性相互作用,从而提高了荧光效率。这使得研究人员可以用更少的光子获得高分辨率的图像,减少了对高激光功率的需求,并最大限度地减少了光损伤。

 

  1. 此外,飞秒脉冲在多光子显微镜中提供了改进的空间分辨率。脉冲持续时间短,峰值功率高,可实现3D高分辨率成像,使研究人员能够在细胞和亚细胞水平上研究样品。

 

超短脉冲持续时间的优势:低于50fs

由于多光子激发的效率很大程度上取决于脉冲期间入射光的峰值功率,因此脉冲越短,峰值功率越高,产生的多光子信号就越强。到目前为止,产生低于80fs极限的超短洁净脉冲的能力相对有限。

 

VALO fs激光系列提供了一种新的方法来克服这一限制,产生更短(低于50秒)和洁净的脉冲。图1显示了双光子和三光子效率与脉冲持续时间的关系[1,2]。多光子事件的效率与激光峰值功率呈非线性关系,对于两个和三个光子过程,相应的信号分别随入射光峰值功率的平方和立方而增加。例如,将脉冲持续时间从200秒减少到50秒,峰值功率增加4倍,双光子效率增加4倍,而三光子效率增加16倍。

多光子显微镜用飞秒激光器插图11:二光子和三光子效率与脉冲持续时间的关系

 

然而,为了在实验中应用这种关系,必须准确地确定样品中的脉冲持续时间。如果显微镜中的光学色散没有得到适当的补偿,脉冲将被拉伸,并且在样品上测量到较低的峰值功率。在这种情况下,脉冲持续时间与高次谐波产生效率之间的关系,无法通过实验精确验证。为了产生足够的非线性SHG和THG信号,在对样品温和的平均功率水平下实现所需的信噪比,必须使用低于50 fs的脉冲和色散预补偿。

 

图2a)显示了样品在VALO fs系列激光器的全带宽下,使用平均功率为4.7 mW的校准网格产生的三次谐波信号,产生~40 fs脉冲。在图2b)中,激光的光谱带宽被限制在10nm的FWHM,在1064 nm左右,产生~160 fs的脉冲。图2a)和图2b)的图像比例相同,但图2b)没有THG信号。只有将较长的~160 fs脉冲中的较低THG信号重新缩放后,才有可能获得高于实验噪声底限的图像,如图2c所示。在这种情况下,需要提高2.5倍的平均激光功率才能获得与更短的低于50 fs脉冲获得的THG信号相当的信噪比[3]。

多光子显微镜用飞秒激光器插图2

2:带有50微米正方形的校准网格(Ibidi)的三次谐波。a) 4.7 mW,全谱短脉冲(<50 fs);VALO系列)b) 6 mW,激光光谱限制在10 nm带宽(~160 fs)c)6mw激光光谱限制在10 nm带宽(~160 fs)下的对比度放大。

 

总之,在多光子显微镜中使用极短飞秒脉冲有几个优点,包括减少光损伤,提高效率,提高空间分辨率,减少背景信号。特别是,超短的低于50秒的脉冲提供了相当高的脉冲峰值功率,这使最佳的信噪比图像只需低得多的平均功率,这反过来减少光漂白,并延长细胞活力。这些优点使多光子显微镜成为研究生物样品的一种有价值的工具,使研究人员能够获得高分辨率。

参考文献:

[1] Shuo Tang, Tatiana Krasieva, Zhongping Chen, Gabriel Tempea, Bruce Tromberg (2006), Effect of pulse duration on two-photon excited fluorescence and second harmonic generation in nonlinear optical microscopy, Journal of Biomedical Optics, 11(2).

[2] Mira Sibai, Hussein Mehidine, Fanny Poulon, Ali Ibrahim, M. Juchaux, J. Pallud, A. Kudlinski,? Darine Haidar (2018), The Impact of Compressed Femtosecond Laser Pulse Durations on Neuronal Tissue Used for Two-Photon Excitation Through an Endoscope, Scientific Reports, 8:11124.

[3] White paper, Sub 50 femtosecond pulse lasers for gentler multiphoton microscopy, H?BNER Photonics. In publication Feb 2023.

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